大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
藥品名稱：
通用名：大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（PAMPK）酶聯(lián)免疫分析試劑盒
使用目的：
本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶
（PAMPK）含量。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用間接法測定標本中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（PAMPK）水平。用
純化的大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（PAMPK）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包
被單抗的微孔中依次加入已知濃度的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（PAMPK）標準品和未知
濃度的 PAMPK 待檢樣品，溫育后，加入生物素標記的抗 IgG 抗體，再與鏈霉親和素-HRP
結(jié)合，形成免疫復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB 在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化
成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白
激酶（PAMPK）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線
計算樣品中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（PAMPK）濃度。
試劑盒組成
1 20 倍濃縮洗滌液 50ml×1 瓶 標準品S1（90 pmol/L） 0.5ml×1瓶
2 鏈霉親和素-HRP 6ml×1 瓶 標準品S2（60pmol/L） 0.5ml×1瓶
3 酶標包被板 12孔×8條 標準品S3（30pmol/L） 0.5ml×1瓶
4 生物素標記的抗-IgG 抗體 6ml×1 瓶 標準品S4（15pmol/L） 0.5ml×1瓶
5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶
9
標準品S5（7.5pmol/L ） 0.5ml×1瓶  
6 顯色劑B液 6ml×1/瓶 10 密封袋 1 個
7 終止液 6ml×1 瓶 11 封板膜 3 張
8 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 12 說明書 1 份
標本要求
1．不能檢測含NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融
操作步驟
1. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復
孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗-IgG抗體，鏈霉親和素-HRP，
其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。然后在標準品孔中加入標準品 50μl，在
樣本反應(yīng)孔中先加入待測樣品10μl再加入樣品稀釋液40μl（樣品zui終稀釋度為5 倍），
蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
3. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用2
4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 4次，拍干。
5. 加生物素標記的抗-IgG 抗體：每孔加入生物素標記的抗-IgG 抗體 50μl（空白孔除外）。
37℃溫育30分鐘
6. 洗滌：操作同 4。
7. 加鏈霉親和素-HRP：每孔加入50μl的鏈酶親和素-HRP（空白孔除外），輕輕振蕩混勻，
37℃溫育30分鐘。
8. 洗滌：操作同 4。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進行。
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的
OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值待入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，
即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔*孔的 OD 值），請先將樣本
稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)（×5×n）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．本試劑不同批號組分不得混用。顯色劑B請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
線形范圍：
5pmol/L -100pmol/L
規(guī)格：
96 人份/盒
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月